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牛結(jié)核血清抗體操作步驟

閱讀次數(shù)：1286 發(fā)布時(shí)間：2013/5/13 10:59:12

操作方法

1．膠體金的制備試驗(yàn)用水均要求三蒸餾水并過(guò)去離子柱，*終去離子水的電阻大于100萬(wàn)Ω。所有容器*終均用去離子水清洗。

（1）采用鞣酸—枸櫞酸鈉還原法制備

A液 1％HAuCl₄ 2.00ml

去離子水 158.00ml

B液 1％枸櫞酸鈉 8.00ml

0.1％Mol/L K₂CO₃ 0.20ml

1％鞣酸 0.20ml

去離子水 31.60ml

將A液和B液分別于60℃水浴30min，并不時(shí)攪拌，迅速將B液加入至A液中，攪拌，顏色為深藍(lán)色，繼續(xù)加熱至100℃，5 min～10min，溶液顏色變?yōu)樯罴t色，自然冷卻后4℃保存。

（2）膠體金鑒定：外觀呈深紅色、晶瑩透亮，迎著日光可見(jiàn)有光帶。電鏡觀察膠體金粒子大小平均為10nm，顆粒大小一致，分布均勻。

2．膠體金與兔抗牛IgG用量比例的確定每ml膠體金所需的穩(wěn)定蛋白量是30µg，根據(jù)試劑用量增加20％，所以每ml膠體金所需的穩(wěn)定兔抗牛IgG量為36µg。

3．金標(biāo)記兔抗牛IgG的制備取所需量的兔抗牛IgG，加入少許去離子水，用0.1Mol/L K₂CO₃溶液調(diào)pH值為9.0（用精密pH試紙測(cè)定），同時(shí)膠體金溶液的pH值也調(diào)至9.0。在磁力攪拌下，將20ml膠體金溶液加入至兔抗牛IgG中，繼續(xù)攪拌10min，加入3.5ml 3％的聚乙二醇（分子量20 000）作為穩(wěn)定劑，以使其*終濃度達(dá)到0.05％，再攪拌15min后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/div>

4．金標(biāo)兔抗牛IgG的純化將金標(biāo)記的兔抗牛IgG以2 500r/min離心15min，以除去膠體金的聚合物，取上清以65 000g離心1h，可見(jiàn)離心物分為三層，上層為淡黃色，含有未結(jié)合的兔抗牛IgG，下層為近黑色，是尚未結(jié)合的膠體金顆粒,*主要的中間層為紅色，是結(jié)合良好的金標(biāo)記的兔抗牛IgG，傾去上層，收集中層液，用含0.1％BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原體積的1／10，過(guò)濾除菌，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/div>

5．金標(biāo)記兔抗牛IgG的鑒定

（1）顆粒大小及均勻度鑒定：取少許金標(biāo)記的兔抗牛IgG，負(fù)染，電鏡觀察顆粒大小及均勻度，并測(cè)量粒子直徑大小。

（2）活性鑒定：將牛IgG點(diǎn)樣于硝酸纖維膜上，直接加金標(biāo)兔抗牛IgG抗體，應(yīng)顯示出明顯的粉紅色斑點(diǎn)。

6．正式試驗(yàn)程序

（1）點(diǎn)樣以打孔器將微孔濾膜制成直徑3mm的膜片。將牛結(jié)核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀釋為40µg/ml，用微量加樣器加1µl抗原于膜片中央，37℃烘干10min。

（2）封閉將膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2％BSA的PBST液中，37℃作用45min，其間振蕩數(shù)次。取出后以蒸餾水洗滌1次，用濾紙吸干。

（3）加待檢血清待檢血清以PBST液做1︰160倍稀釋。將膜片浸入其中，37℃作用1h，其間振蕩數(shù)次。取出后，以PBST液洗滌后，濾紙吸干。此步同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照。

（4）加金標(biāo)抗體以PBST液將金標(biāo)液作1︰10稀釋，將膜片浸入其中，37℃作用2h，中間振蕩數(shù)次。

（5）銀染將膜片從金標(biāo)液中取出，于去離子水洗滌3次，每次3min。然后將膜片浸入暗室中的銀染色液中，室溫下作用10min，移入定影液中，室溫作用5min。然后用去離子水沖洗，自然干燥后觀察結(jié)果。